Implementeer snel flowcytometerontwerpen met behulp van zeer nauwkeurige gegevensverwervingsmodules

Flowcytometrie wordt op grote schaal gebruikt door clinici en diagnostici om celkarakteristieken te analyseren. Cel voor cel evalueren zij optisch het proteïnegehalte, de gezondheid van het bloed, de korrelgrootte en de celgrootte, naast andere attributen. Hoewel het uiterst gevoelige systemen zijn, staan ontwerpers van cytometers onder voortdurende druk om de analysetijd te versnellen, hetgeen nieuwe benaderingen vereist voor zowel flowcytometrie als de bijbehorende elektronica.

Cytometers onderwerpen individuele cellen aan laserlicht om verstrooiings- en fluorescentiesignalen te creëren. Om het resulterende licht snel en nauwkeurig op te vangen en om te zetten in digitale signalen zijn een lawinefotodiode (APD) en complexe elektronica nodig. Het ontwerpen en uitvoeren van de schakelingen voor dit proces kan veel tijd in beslag nemen, vooral gezien het feit dat systemen voor het verzamelen van flowcytometrische gegevens snelle apparaten met weinig ruis vereisen om de nauwkeurigheid van het systeem te waarborgen.

Om kosteneffectieve ondersteuning te bieden voor snellere flowcytometrie-analyses, kunnen ontwerpers snelheids- en nauwkeurigheidsproblemen oplossen met een oplossing voor gegevensverwerving die interne versterkerdrivers en een analoog/digitaal-omzetter (ADC) omvat.

Dit artikel zal in het kort laten zien hoe flowcytometriesystemen werken. Vervolgens wordt de ADAQ23878 van Analog Devices geïntroduceerd, een 18-bit ADC-module, en wordt getoond hoe deze kan worden gebruikt voor het ontwerpen van een flowcytometerdetectie- en -conversietrap. Ook zal een bijbehorende evaluatiekit worden geïntroduceerd.

Moderne flowcytometrie beginselen

Moderne flowcytometrie is een geautomatiseerd proces dat cel- en oppervlaktemoleculen analyseert, karakteriseert en verschillende celtypes in een heterogene celpopulatie definieert. Zonder rekening te houden met de voorbereidingstijd, die meer dan een uur kan bedragen, voert het instrument in minder dan een minuut een beoordeling uit van 10.000 afzonderlijke cellen met drie tot zes kenmerken.

Om dit mogelijk te maken, is de één-cel-preparatiestap van flowcytometrie van cruciaal belang. De organisatie van de monsters gebeurt in een hydrodynamische mantelvloeistof om cellen of deeltjes te concentreren in een smalle, uit één cel bestaande monsterstroom voor analyse. Bij deze transformatie moeten de afzonderlijke cellen hun natuurlijke biologische kenmerken en biochemische bestanddelen behouden.

Afbeelding 1 toont een schema van een flowcytometer-instrument dat bovenaan begint met het monster van meerdere cellen.

Afbeelding 1: Schema van een flowcytometer, van schedefocus tot gegevensverzameling. (Bron afbeelding: Wikipedia, bewerkt door Bonnie Baker)

De zes hoofdcomponenten van de flowcytometer zijn een flowcel, een laser, een lawinefotodiode (APD), een transimpedantieversterker (TIA), een ADC en een computer voor het verzamelen en analyseren van gegevens.

De flowcytometer heeft een vloeistofstroom of mantelvloeistof, die vernauwd is om de cellen in één enkele file door de lichtbundel te voeren en uit te lijnen. Het laserlicht vangt één cel per keer, waardoor een voorwaarts verstrooid lichtsignaal (FSC) en een zijwaarts verstrooid lichtsignaal (SSC) worden gecreëerd. Fluorescentielicht wordt gesorteerd met behulp van spiegels en filters en vervolgens versterkt door een APD.

De volgende stap is het detecteren, digitaliseren en analyseren van de resulterende lichtoutput nadat deze de APD heeft geraakt. Voor detectie is de Analog Devices LTC6268 500 megahertz (MHz) FET-ingangsversterker met ultralage biasstroom en lage spanningsruis ideaal voor de snelle TIA die nodig is voor detectie.

Afbeelding 2: De TIA-schakeling maakt gebruik van een APD (PD₁) en een FET-versterker met lage ingangsstroom om ultralage fotodiodestromen om te zetten in een uitgangsspanning op IN1+. (Bron afbeelding: Bonnie Baker)

Het is van essentieel belang dat deze versterkerschakeling met een zo groot mogelijke bandbreedte wordt ontworpen, zodat parasitaire capaciteiten tot een minimum moeten worden beperkt. Zo beïnvloedt de parasitaire terugkoppelcapaciteit, C, de stabiliteit en de bandbreedte van Afbeelding 2. Ongeacht de keuze van de weerstandsverpakking, zal er altijd een parasitaire capaciteit zijn in het terugkoppelingstraject van de versterker. Een 0805-pakket, dat een langere afstand tussen de eindkappen en de laagste parasitaire capaciteit heeft, verdient echter de voorkeur voor hogesnelheidstoepassingen.

Het vergroten van de afstand tussen de eindkappen van R₁ is niet de enige manier om de capaciteit te verlagen. Een andere manier om de plaat-tot-plaat-capaciteit te verminderen is het afschermen van de E-veldpaden die aanleiding geven tot de parasitaire capaciteit door een extra massaspoor onder de weerstand R₁ te plaatsen (Afbeelding 3).

Afbeelding 3: Door een massaspoor onder de terugkoppelingsweerstand aan te brengen, wordt het E-veld weggeleid van de terugkoppelingszijde en naar de aarde gedumpt. (Bron afbeelding: Analog Devices)

In dit geval houdt de methode in dat een kort massaspoor wordt geplaatst onder en tussen de weerstandskussens bij de uitgang van de TIA. Deze techniek levert een parasitaire capaciteitswaarde op van 0,028 picofarads (pF) met een TIA-bandbreedte van 1/(2π*R_F*C_PARASITIC), wat neerkomt op 11,4 MHz.

De optische lichtsignalen gaan naar verschillende lawinedioden met passende optische filters. De APD, de TIA en het ADC-systeem zetten deze signalen om in hun digitale weergave en sturen de gegevens naar de microprocessor voor verdere analyse.

Moderne instrumenten hebben gewoonlijk meerdere lasers en APD's. De huidige commerciële apparaten hebben tien lasers en dertig lawinefotodiodes. Door het aantal laser- en fotomultiplicatordetectoren te verhogen, kunnen meerdere anti-lichaampjes worden gelabeld om doelpopulaties aan de hand van fenotypische markers nauwkeurig te identificeren.

Toch hangt de snelheid van de analyse af van een fijne balans tussen:

• De snelheid van de vloeistofmantel
• Het vermogen van het hydrodynamische focusproces om ééncellijnen te vormen
• De tunneldiameter
• Het vermogen om de integriteit van een cel te bewaren
• De elektronica

Flowcytometrie akoestische focussering

Hoewel de toevoeging van meerdere lasers en APD's de analyse en identificatie versnelt, kunnen de recentste moderne flowcytometriemethoden voor afzonderlijke cellen in het beste geval gegevens verzamelen over maximaal één miljoen afzonderlijke cellen per minuut. Voor vele toepassingen, zoals het opsporen van circulerende tumorcellen in het bloed op niveaus van niet meer dan 100 cellen per milliliter, is dit onvoldoende. In klinische toepassingen voor zeldzame cellen vereisen tests regelmatig de tijdrovende analyse van miljarden cellen.

Het alternatief voor het hydrodynamisch gefocusseerde celbereidingsproces is een akoestisch focusproces. Hierbij wordt een piëzo-elektrisch materiaal, zoals loodzirkonaattitanaat (PZT), aan een glazen capillair bevestigd om elektrische impulsen om te zetten in mechanische trillingen (Afbeelding 4a). Door een PZT te gebruiken om de zijwanden van een glazen capillair te laten trillen op de resonantiefrequentie van de rechthoekige stroomcel, genereert het systeem een verscheidenheid van akoestische staande golven met variërende aantallen drukknopen.

Afbeelding 4: Een illustratie van een akoestische stromingscel gemaakt met een rechthoekig glazen capillair (a). De plaats van de eerste drie drukknopen voor een capillair met vaste breedte (b). (Bron afbeelding: National Center for Biotechnology Information)

Deze PZT-frequentieknooppunten richten stromende deeltjes in meerdere, discrete stroomlijnen uit (Afbeelding 4b). De akoestische doorstroomcel maakt gebruik van een lineaire, staande akoestische golf om af te stemmen op verschillende golflengten door enkele of meervoudige harmonischen te creëren. Zoals voorspeld door het eenvoudige lineaire staande-golfmodel, produceren de cellen in het monster enkele of talrijke enkele-cellijnen binnen de stromingskamer.

Met deze nauwkeurige organisatie van cellen kan de breedte van de stromingsmantel tunnel verbreden om snellere stroomsnelheden langs de laserstraal mogelijk te maken (Afbeelding 5).

Afbeelding 5: Met de hydrodynamische bemonsteringsstroom (c. en d.), naarmate de hulsbreedte toeneemt, verstrooien de celmonsters, waardoor het optische meetproces wordt bemoeilijkt. Akoestisch gerichte monsterstromen (a. en b.) de cellen in één rechte lijn houden, ongeacht de hulsbreedte. (Afbeelding bron: Thermo Fischer Scientific)

Traditionele hydrodynamische focussering (Afbeelding 5c.) rangschikt de eencellijnen ter voorbereiding van het laserscannen. Hoewel een bredere trechter voor de kern van de bemonsteringsstroom een hogere omhullingsmateriaalsnelheid mogelijk maakt (Afbeelding 5d.), resulteert dit ook in de verspreiding van de eencellige organisatie, waardoor signaalvariatie ontstaat en de kwaliteit van de gegevens wordt aangetast.

Akoestische focussering (Afbeelding 5a.) positioneert biologische cellen en andere deeltjes in strakke uitlijning, zelfs met een bredere tunnel. Deze nauwkeurige celuitlijning maakt hogere bemonsteringsfrequenties mogelijk met behoud van gegevenskwaliteit (Afbeelding 5b.).

In de praktijk verhoogt de akoestische focus van de flowcytometrie de frequentie van de celbemonstering met ~20x (Afbeelding 6).

Afbeelding 6: Vergelijking van de bemonsteringstijd voor verschillende stroomcytometrieapparatuur op basis van vloeistofstromingscytometrie (A, B, C) versus akoestische focusseringscytometrie (D). (Bron afbeelding: Thermo Fischer Scientific)

In Afbeelding 6 maakt de apparatuur van A, B en C gebruik van hydrodynamische technologie, terwijl D gebruik maakt van de stroombenadering van de akoestische focusserende cytometrie.

Akoestische focussering flowcytometrie gegevensverwerving

Het ontwerp van de elektronica voor akoestisch focusserende flowcytometrie-apparatuur vereist hogesnelheidsfotodetectie-elektronica om de snelheid van de bloedcellen en de hulsvloeistof door het mondstuk met grotere diameter te kunnen opvangen. De eerder genoemde LTC6268 met 600 MHz hoge snelheid, in combinatie met een speciale 0805-weerstandspakketindeling, brengt de optische detectiesnelheid op 11,4 MHz (Afbeelding 7, links). De uitgang van de LTC6268 wordt toegevoerd aan een Analog Devices ADAQ23878 ADC voor digitalisering.

Afbeelding 7: De ADAQ23878 ADC digitaliseert het optische signaal van de fotodiode (PD₁) en de TIA-schakeling (links). (Bron afbeelding: Bonnie Baker)

De ADAQ23878 is een 18-bit, 15 megasamples per seconde (MSPS), precisie, hoge-snelheid system-in-package (SIP) data-acquisitie oplossing. Het verkort de ontwikkelingscyclus van precisiemeetsystemen aanzienlijk door de ontwerplast van de selectie, optimalisatie en lay-out van input driver-componenten over te dragen van de ontwerper naar het apparaat.

De modulaire aanpak van de SIP vermindert het aantal componenten voor het eindsysteem door meerdere gemeenschappelijke signaalverwerkings- en conditioneringsblokken in één apparaat te combineren, samen met de hoge-snelheid, 18-bit, 15 MSPS successive approximation register (SAR) ADC. Deze blokken omvatten een ruisarme, volledig gedifferentieerde ADC-stuurversterker, en een stabiele referentiebuffer.

De ADAQ23878 bevat ook de kritische passieve componenten die gebruik maken van Analog Devices' iPassive-technologie om temperatuurafhankelijke foutbronnen te minimaliseren en de prestaties te optimaliseren. De snel-afreagerende stuurtrap van de ADC draagt bij tot zijn vermogen om snelle gegevensverwerking te verzekeren.

Evaluatie van de ADAQ23878 µModule

Om de ADAQ23878 te evalueren, levert Analog Devices het EVAL-ADAQ23878FMCZ-evaluatiebord (Afbeelding 8). Het bord demonstreert de prestaties van de ADAQ23878 μModule en is een veelzijdig instrument voor het evalueren van een flowcytometrie front-end ontwerp, en een verscheidenheid aan andere toepassingen.

Afbeelding 8: Het EVAL-ADAQ23878FMCZ-evaluatiebord voor de ADAQ23878 heeft onboard voedingscircuits, wordt geleverd met bijbehorende software voor besturing en gegevensanalyse, en is SDP-H1 compatibel. (Bron afbeelding: Analog Devices)

Het EVAL-ADAQ23878FMCZ-evaluatiebord vereist een personal computer met Windows 10 of hoger, een ruisarme precisie-signaalbron en een banddoorlaatfilter geschikt voor 18-bit testen. Het evaluatiebord heeft de ADAQ23878 ACE plugin en SPD-H1-driver nodig.

Conclusie

Het onderzoek van één biologische cel tegelijk met standaard hydrodynamische focus-flowcytometrietechnieken is succesvol geweest, maar met de behoefte aan snellere analyse is er een verschuiving opgetreden naar technieken op basis van akoestische focus-flowmethoden. De elektronica ter ondersteuning van meer geavanceerde flowcytometrie moet echter ook worden verbeterd, terwijl ruimte, kosten en ontwikkelingstijd tot een minimum moeten worden beperkt.

Zoals getoond kunnen de LTC6268 hoge-snelheid opamp en de ADAQ233878 precisie, hoge-snelheid, μModule gegevensverwervingoplossing gecombineerd worden tot een compleet gegevensverwervingssysteem voor geavanceerde flowcytometrie-apparatuur.